Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm Corynespora cassiicola

v

SUMMARY


LE VAN HUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City. August, 2006.
“Studying genetic variation of Corynespora cassiicola population, destructive fungal
pathogen of Hevea brasiliensis Muell. Arg in Lai Khe rubber experimental station of
Rubber Research Institute of Vietnam (RRIV), was carried out by using RAPD
technique.”
Corynespora leaf fall disease caused by C. cassiicola was considered as one of the
most harmful leaf diseases in Hevea brasiliensis Muell. Arg.
In Vietnam, the disease was first detected in August, 1999 in Lai Khe rubber experimental
station of Rubber Research Institute of Vietnam (RRIV). At present, the disease is
spreading and can develope into epidemics in future. A special attention has been made to
determine the extent of genetic variation of the pathogen.
Therefore, 11 isolates collected from various clones of Hevea brasiliensis Muell.
Arg were purified to single spore. Fungal isolates were inoculated in broth culture and
total DNA extracted. Three RAPD markers (OPL-08, OPM-O5 and OPD-18) were used
to investigate the genetic diversity of these isolates. Cluster analysis of 35 amplified DNA
fragments (RAPD data) showed that 11 isolates could be placed into two groups. Genetic
similarity of these analyzed iolates was a range from 0.43 to 0.94. The result indicated
that there is a significant genetic variation among these isolates. It seems that
morphological differences did not associate with molecular characters.
This preliminary study would be useful for a better under standing of disease
outbreaks, predicting future disease development and developing effective strategy in
breeding for disease resistant clones. It is indicated that RAPD will be extended to assess
intra-specific variation in C. cassiicola isolates from rubber trees in Vietnam.

vi
MỤC LỤC
PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình x

Danh sách các bảng xi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích 2
1.3. Yêu cầu 2
1.4. Nội dung công việc 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg 3
2.1.1. Phân loại học 3
2.1.2. Nguồn gốc 3
2.1.3. Đặc điểm thực vật học 3
2.1.4. Vai trò và tình hình sản xuất 3
2.1.5. Sâu bệnh 4
2.2. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su. 5
2.2.1. Phân loại học 5
2.2.2. Giới thiệu về khuẩn ty, khuẩn lạc, bào tử 5
2.2.3. Phổ kí chủ, sự xâm nhâm, lan truyền của nấm C. cassiicola 7
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy 7
2.3. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg 8

vii
2.3.1. Nguyên nhân, triệu chứng, hậu quả và cách phòng trị của bệnh rụng lá Corynespora 8
2.3.2. Yếu tố phát sinh bệnh trên cây cao su và sự hình thành nòi mới của nấm C. cassiicola 10
2.4. Giới thiệu về thông tin di truyền, tính đa dạng di truyền và chỉ thị 11
2.4.1. Thông tin di truyền 11
2.4.2. Tính đa dạng di truyền 12
2.4.3. Chỉ thị 12
2.5. Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 13
2.6. Kỹ thuật PCR 14
2.6.1. Giới thiệu kỹ thuật PCR 14
2.6.2. Các bước cơ bản quy trình chuẩn của PCR. 14
2.6.3. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng 15
2.7. Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 19
2.8. Kỹ thuật STS (Sequence – Target Sites) 20
2.9. Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) 20
2.10. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 20
2.10.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD 20
2.10.2. Một số vấn đề trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD thường gặp phải 22
2.10.3. Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD 22
2.10.4. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 23
2.10.5. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 23
2.10.6. Sự cách tân của kỹ thuật RAPD 24
2.11. Kỹ thuật AFLP 24
2.12. Nghiên cứu trong và ngoài nước 25
2.12.1. Những nghiên cứu về C. cassiicola ngoài nước 25
2.12.2. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong nước 28
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 29
3.1.1. Giai đoạn 1 29
3.1.2. Giai đoạn 2 29
3.2. Đối tượng nghiên cứu 29
3.3. Nội dung và phương pháp 29
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu 29

viii
3.3.2. Phân lập 30
3.3.3. Nhân sinh khối 32
3.3.4. Tách chiết DNA 33
3.3.5. Thực hiện phản ứng RAPD 35
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43
4.1. Kết quả lấy mẫu, phân lập và nhân sinh khối 43
4.1.1. Kết quả lấy mẫu, phân lập 43
4.1.2. Kết quả nhân sinh khối 47
4.2. Kết quả ly trích 48
4.3. Thiết lập qui trình RAPD và đánh giá độ đa dạng di truyền của các chủng nấm C. cassiicola
phân lập được từ vườn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống –trại thực ngiệm Lai Khê–
VNCCSVN (Bình Dương). 51
4.3.1. Thí nghiệm 1: khảo sát qui trình RAPD của Silva và cộng sự, 2003. 51
4.3.2. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD. 53
4.3.3. Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố MgCl
2
, dNTP, primer, DNA, Taq -
polymerase (Promega) lên phản ứng RAPD. 54
4.3.4. Đánh giá độ đa dạng di truyền của các chủng nấm C. cassiicola phân lập được từ vườn
tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống tại trại thực nghiệm Lai Khê – VNCCSVN (Bình
Dương). 55
4.3.5. Phân tích kết quả phản ứng RAPD bằng phần mềm NTSYS 59
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63
5.1. Kết luận 63
5.2. Đề nghị 63
5.3. Hạn chế của đề tài 64
PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 65
PHỤ LỤC 65


ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR: Polymerase Chain Reaction.
PDA: Potato Dextrose Agar.
PSA: Potato Saccharose Agar.
EtBr: Ethidium Bromide.
TE: Tris EDTA.
TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA.
RFLP: Restriction Fragments Length Polymorphism.
ITS: Internal Transcribed Spacer.
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
Bp: base pairs
rRNA: ribosomal RNA.
dvt : Dòng vô tính
BVTV: bảo vệ thực vật
VNCCSCN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam
KTCB : Kiến Thiết Căn Bản











x
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam. 9
Hình 2.2 Sơ đồ các bước phản ứng chuỗi polymerase 15
Hình 2.3 Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR 20
Hình 4.1 Triệu chứng đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora 44
Hình 4.2 Triệu chứng biến thiên của bệnh rụng lá Corynespora. 44
Hình 4.3 Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá 45
Hình 4.4 Bào tử của nấm C. cassiicola. 45
Hình 4.5 Khuẩn lạc nấm C. cassiicola 46
Hình 4.6 Màu sắc sợi nấm trên môi trường lỏng. 47
Hình 4.4 Kết quả li trích DNA tổng số theo qui trình của Lee và Taylor 48
Hình 4.8 DNA tổng số của 11 nguồn nấm li trích theo qui trình mới 50
Hình 4.9 Các mẫu DNA sau khi tiến hành pha loãng 51
Hình 4.10 Kết quả PCR ở thí nghiệm 1, primer OPM-O5, nguồn nấm 4, 5, 6 52
Hình 4.11 Sản phẩm PCR của thí 2 nghiệm khi thực hiện với primer 53
Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của thí nghiệm 3 54
Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 11 nguồn nấm C. cassiicola 5 7
Hình 4.14 Phát hiện băng bằng chức năng detect băng 58
Hình 4.15 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS 60
Hình 4.16 Cây phả hệ (dendrogram) của 11 nguồn nấm C. cassiicola 61

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG



Bảng 3.1 Thành phần phần môi trường PSA, PDA 30
Bảng 3.2 Các primer dùng cho phản ứng RAPD 35
Bảng 3.3 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 37
Bảng 3.4 Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 37
Bảng 3.5 Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 37
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD của nghiệm thức 1 – 6 38
Bảng 3.7 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD của nghiệm thức 7 – 10 40
Bảng 4.1 Danh sách các nguồn nấm C. cassiicola phân lập được 46
Bảng 4.2 Kết quả sau khi nhân sinh khối nấm trong môi trường lỏng 47
Bảng 4.3 Chương trình nhiệt được xây dựng ở thí nghiệm1 52
Bảng 4.4 Thành phần hóa chất phản ứng RAPD thu được sau thí nghiêm 1, 2, 3 55
Bảng 4.5 Chương trình nhiệt được xây dựng sau thí nghiệm 1, 2, 3 55

1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cũng như nhiều loại cây trồng khác cây cao su bị nhiễm nhiều loại bệnh. Trong
đó đáng kể nhất là bệnh rụng lá Corynespora gây ra bởi nấm C. cassiicola đang được
xem là bệnh chính ở các vùng trồng cao su trên thế giới (P. romruensukharom và
cộng sự, 2005; Silva và cộng sự, 2003, 2004).
Ở Việt Nam hiện nay số lượng dvt bị nhiễm bệnh tăng lên nhiều và cũng đã
xuất hiện tại một số công ty cao su tại Đông Nam Bộ. Hiện nay bệnh đang trong giai
đoạn tích lũy và có thể bùng phát trong tương lai (Phan Thành Dũng, 2006). Nguy
cơ còn cao hơn nữa do tác động của sự thương mại hóa các sản phẩm nông nghiêp,
các chương trình hợp tác trao đổi giống, sự đe dọa của khủng bố sinh học. Sự quan
tâm hiện nay là xác định sự đa dạng của nguồn bệnh.
Mặc dù những phương pháp truyền thống như: quan sát hình thái đặc điểm phát
triển, hình thái bào tử, cây chỉ thị.v.v. đã được sử dụng để phát hiện sự đa dạng di
truyền của nguồn bệnh. Nhưng những khảo nghiệm này gặp phải hạn chế lớn là lệ
thuộc vào sự thay đổi của môi trường (P. romruensukharom và cộng sự, 2005).
Trên thế giới kỹ thuật RAPD đã được áp dụng để nghiên cứu về đa dang di
truyền của nấm C. cassiicola. Ở Việt Nam việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân
tử trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu về nấm C. cassiicola chưa nhiều trong khi
bệnh rụng lá Corynespora đang có nguy cơ bùng phát. Do đó chúng tôi thực hiện đề
tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm Corynespora cassiicola (Berk.
& Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) tại trại thực
nghiệm Lai Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD” là vấn
đề mang tính cấp bách, rất phù hợp với tình hình khách quan. Thông tin thu được từ
đề tài sẽ làm cơ sở cho các chiến lược quản lý, phòng trừ bệnh và các nghiên cứu
tiếp theo.
2

1.2. Mục đích
Mục đích của đề tài là phân tích đa dạng di truyền của các dòng nấm C.
cassiicola, làm cơ sở cho các chiến lược phòng trừ bệnh và các nghiên cứu tiếp theo
Từ mục đích trên, nghiên cứu được hiện với mục tiêu cụ thể sau:
Phân lập, tách đơn bào tử nấm C. cassiicola.
Tối ưu hóa qui trình RAPD phù hợp với nấm C. cassiicola.
Thực hiện phản ứng RAPD trên các dòng nấm thu thập được.
Đánh giá được độ đa dạng di truyền của các dòng nấm C. cassiicola làm
cơ sở cho việc xây dựng các chiến lược phòng trừ bệnh và các nghiên cứu sau
này.
1.3. Yêu cầu
Hiểu biết căn bản về bệnh cây cao su, bệnh rụng lá Corynespora nhận diện
được triệu chứng đặc trưng của bệnh.
Nắm vững quy trình phân lập, tách đơn bào tử, nhân sinh khối nấm C.
cassiicola
Nắm vững kỹ thuật RAPD.
Nắm vững cách sử dụng phần mềm NTSYSpc2.1.
Vận hành các máy móc thiết bị hiện có, củng cố tiến tới nắm vững kiến
thức đã học.
1.4. Nội dung công việc
Phân lập nguồn nấm C. cassiicola.
Nuôi cấy, tách đơn bào tử, nhân sinh khối các nguồn nấm đã phân lập.
Tách chiết DNA từ các dòng nấm thu được sau quá trình nhân giống.
Khảo sát qui trình RAPD.
Thực hiện kỹ thuật RAPD sử dụng 3 primer.
Phân tích kết quả RAPD bằng phần mềm NTSYCpc2.1.
3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg
2.1.1. Phân loại học
Cây cao su trên thế giới thuộc vào năm họ thực vật sau: Euphorbiaceae,
Moraceae, Apocynaceae, Aslepiadaceae, Compositae. Trong đó mỗi họ lại có
nhiều giống, mỗi giống có nhiều loại. Nhưng cây cao su thuộc loại Hevea
brasiliensis (giống Hevea, họ Euphorbiaceae) là cây duy nhất được chọn để canh
tác đại qui mô (Nguyễn Hữu Trí, 2004).
2.1.2. Nguồn gốc
Cây cao su có nguồn gốc từ vùng rừng nhiệt đới, lưu vực sông Amazone
Nam Mĩ. Được du nhập vào Việt Nam năm 1897. Đến đầu thế kỷ 20 được trồng
thành đồn điền tại Đông Nam Bộ. Đầu thập niên 50 một số diện tích cao su cùng
định hình tại Tây Nguyên và miền Trung.
2.1.3. Đặc điểm thực vật học
Cây cao su (cây tạo mủ) thuộc loại thân gỗ, to, cao. Ở nhưng cây lâu năm có
thể cao từ 20 đến 30 mét.
Cấu tạo của thân cao su có phần quan trọng là vỏ thân, đây là bộ phận sản
sinh ra nhựa mủ quyết định đến năng suất sản lượng mủ.
Lá cao su mọc cách, có ba lá chét nhỏ cuống dài, có hình bầu dục, đuôi
nhọn, mặt nhẵn gân song song. Đối với cây cao su thì lá có vai trò rất quan trọng,
ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng mủ.
Về phương diện sinh thái cây cao su phát triển tốt ở vùng xích đạo. Đòi hỏi
nhiệt độ trung bình 25
0
C, lượng mưa 1500 ml mỗi năm, có thể chịu đựơc hạn
nhiều tháng, ít đòi hỏi về chất lượng đất, ở nước ta cây cao su được trồng từ Bắc
đến Nam (Nguyễn Hữu Trí, 2004).
2.1.4. Vai trò và tình hình sản xuất
Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất
nhiều ngành công nghiệp. Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các

Xem chi tiết: Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm Corynespora cassiicola